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StrutturaeAmplifDNA .pdf



Nome del file originale: StrutturaeAmplifDNA.pdf
Titolo: Microsoft PowerPoint - StrutturaeAmplifDNA
Autore: Bruna

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Struttura ed
Amplificazione
del DNA

THE FLOW OF GENETIC INFORMATION

2
DNA

3
RNA

PROTEIN

1
DNA
1. REPLICATION
2. TRANSCRIPTION
3. TRANSLATION

(DNA SYNTHESIS)
(RNA SYNTHESIS)
(PROTEIN SYNTHESIS)

DNA Structure and Chemistry
a). Evidence that DNA is the genetic information
i). DNA transformation – know this term
ii). Transgenic experiments – know this process
iii). Mutation alters phenotype – be able to define
genotype and phenotype
b). Structure of DNA
i). Structure of the bases, nucleosides, and nucleotides
ii). Structure of the DNA double helix
iii). Complementarity of the DNA strands
c). Chemistry of DNA
i). Forces contributing to the stability of the double helix
ii). Denaturation of DNA

Structures of the bases
Purines

Pyrimidines

Adenine (A)

Thymine (T)

5-Methylcytosine (5mC)

Guanine (G)

Cytosine (C)

Nucleoside

[structure of deoxyadenosine]

Nucleotide

Nomenclature

Base

Nucleoside
+deoxyribose

Purines
adenine
guanine

adenosine
guanosine

hypoxanthine

inosine

Pyrimidines
thymine
cytosine

thymidine
cytidine
+ribose

uracil

Nucleotide
+phosphate

uridine

5’

3’

A-T base pair
Hydrogen bonding of the bases

G-C base pair
Chargaff’s rule: The content of A equals the content of T,
and the content of G equals the content of C
in double-stranded DNA from any species

Double-stranded DNA
5’

3’

Major groove
Minor groove

“B” DNA
3’

5’

3’

5’

Chemistry of DNA
Forces affecting the stability of the DNA double helix
• hydrophobic interactions - stabilize
- hydrophobic inside and hydrophilic outside
• stacking interactions - stabilize
- relatively weak but additive van der Waals forces
• hydrogen bonding - stabilize
- relatively weak but additive and facilitates stacking
• electrostatic interactions - destabilize
- contributed primarily by the (negative) phosphates
- affect intra-strand and inter-strand interactions
- repulsion can be neutralized with positive charges
(e.g., positively charged Na+ ions or proteins)

Charge repulsion

Stacking interactions

Charge repulsion

Model of double-stranded DNA showing three base pairs

Denaturation of DNA
Double-stranded DNA

Strand separation
and formation of
single-stranded
random coils

Extremes in pH or A-T rich regions
high temperature denature first

Cooperative unwinding
of the DNA strands

Electron micrograph of partially melted DNA

Double-stranded, G-C rich
DNA has not yet melted

A-T rich region of DNA
has melted into a
single-stranded bubble

• A-T rich regions melt first, followed by G-C rich regions

Hyperchromicity

Absorbance

Absorbance maximum
for single-stranded DNA

Absorbance
maximum for
double-stranded DNA

220

260

300

The absorbance at 260 nm of a DNA solution increases
when the double helix is melted into single strands.

Percent hyperchromicity

DNA melting curve
100

50

0
50

70

90

Temperature oC

• Tm is the temperature at the midpoint of the transition

Percent hyperchromicity

Tm is dependent on the G-C content of the DNA

E. coli DNA is
50% G-C

50

60

70

80

Temperature oC

Average base composition (G-C content) can be
determined from the melting temperature of DNA

PCR da DNA
genomico

Amplificazione del
DNA
A che ci serve amplificare tramite PCR delle sequenze di
DNA note?
- per sequenziarle, se ci si aspettano mutazioni o polimorfismi
- per usarle come sonde (ibridaz. South. North. In-situ)
- per trasformare delle cellule (costrutti con funzioni
specifiche da esprimersi nelle cellule)
- per clonarle
- per mutagenizzarle
- per preparare dei costrutti,
- per fare diagnostica e per n + 1 scopi

La reazione a catena della DNA polimerasi
PCR “polymerase chain reaction”
Descrizione della tecnica, metodo, componenti, variabili,
strumenti = termociclatori
Tecnica: amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite
DNA polimerasi (adesso e’ termo resistente)
DNA polimerasi di “thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi)
- salto di qualita’ del metodo, molto piu’ efficiente.
Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e
medica, nella diagnostica e medicina forense (legale)
Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA
polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo
sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale).

Come sintetizza la polimerasi
Ricordare per sempre:
Le polimerasi sintetizzano DNA o RNA in direzione 5’
partire da un innesco 3’ libero su un templato.

3’ a

Il DNA e’ una molecola a doppia elica, le due eliche sono
antiparallele, la sintesi avviene sempre nella stessa direzione
per ognuna delle eliche, quindi in verso opposto su ognuna di
esse, ma sempre 5’ 3’
La polimerasi poiche’ sintetizza in direzione 5’ 3’ scorrera’
sulla elica di DNA templato in direzione 3’ 5’

Come si fa la PCR, in cosa consiste
Reazione a Catena di Polimerizzazione RCP

PCR

- amplificazione tramite sintesi de-novo di nuovi filamenti di DNA
da parte della DNA polimerasi di Thermophilus aquaticus
- definizione: reazione ad amplificazione esponenziale con un
raddoppio teorico della quantità di DNA ad ogni ciclo di sintesi.
La DNA polimerasi di cosa ha bisogno ?
- del templato denaturato a singolo filamento (forca replicativa?)
- dei primers (inneschi)
- dei nucleotidi per la sintesi
- del tampone
- del Magnesio

PCR: amplificazione
n.ro cicli

n.ro sequenze bersaglio

1

0

3

2

10

256

15

8192

20

262.144

25

8.388.608

30

268.435.456

La sequenza bersaglio è la
sequenza di DNA sintetizzata
tra i due primers

Occorre ~1µ
µg di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter
essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 µg of DNA
potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1 µ g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 µ g in 25 cicli e 27 µ g in
30 cicli.

\Ä v|vÄÉ ;ÇÉÇ |Ä äxÄÉv|Ñxwx<
Primer frw.

Denaturazione

+
_

5’

3’

3’

5’

= seq +
Primer rev.

= seq -

2 eliche

Annealing a ~ 50°
°- 60°
°C
pr. rev.

5’
3’

pr. frw.

3’
5’

Extension (Polimerizzazione)
3’

5’

3’

5’
5’

I CICLO

3’

3’

5’

Denaturazione
5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

4 eliche

Ciclo continuo
Annealing Extension (Polimerizzazione)
3’

5’

5’

3’
5’

3’

3’

5’
3’

5’

5’

5’

II CICLO 4 eliche

3’

3’

5’

3’

Denaturazione
5’
3’
5’
3’

3’
5’
3’
5’

5’
3’
5’
3’

III CICLO

3’
5’
3’
5’

16 eliche

8 eliche
IV ciclo

32 eliche…..
La crescita e’ esponenziale : teoricamente ad ogni ciclo un raddoppio
di DNA, ma dipende dalla messa a punto del protocollo di reazione,
molte variabili da ottimizzare
- senza contaminazioni amplificazione da quantita’ minime di DNA
(famtogrammi o singole cellule)
- genoma diploide

2 doppie eliche di templato in interfase

Le condizioni di reazione di ogni
passaggio
vanno determinate per i tempi, temperature e
quantita’(conc.) ogni ciclo = 3 passaggi (fasi)
I

passaggio denaturazione (5-10 min. quella iniz. della reazione)

II passaggio appaiamento dei primers (annealing)
III passaggio di sintesi del DNA,
estensione del filamento di DNA a partire dai primers (inneschi)

Fine del ciclo
Alla fine dei cicli programmati viene fatta una estensione di
5 -10 min. per assicurare il completamento della sintesi di
tutti i nuovi frammenti iniziati e non terminati

Le componenti per la reazione:
Volume di reazione: da 10 a 50 µl (max 100 µl) per una preparativa.
Il DNA, abbastanza pulito, non deve essere purissimo, la quantita’ puo’ essere molto
poca, normamlmente si usano 10-100 ng di un genoma eucariotico, più di 500 ng
possono inibire della reazione

La Taq polimerasi, DNA polimerasi di “thermophilic eubacterium thermus
acquaticus” resiste a 95°, frequenza di errore superiore a quelle di eucarioti, 26 x106, ora ce ne sono per diverse finalita’, a basso tasso di errore = high fidelity 8.5 x10- 6,
e per frammenti lunghi genomici. Se ne usa da meno di 1U fino a 5 U, ma se si fanno
molti cicli conviene spezzare la reazione in due fasi e riaggiungerla

dNTPs: conc. standard 100 µM per ognuno
Il tampone: sale di Tris, il Mg concentrazione empirica tra 0. 5 mM e 4. 5 mM,
ogni Taq pol. ha un tampone con concentrazioni saline (buffer) ideali

I primers: scelti per funzionare in coppia, evitare GC ed AT finali, palindromi,
sequenze complementari, devono avere TM(melting) simili,

H2O q.b. sterile incontaminata per arrivare al volume finale

Fasi del ciclo, passaggi
I denaturazione, a 94°- 95°C, il Tempo a seconda della lunghezza del
frammento da amplificare. Prima del I ciclo si tiene a 95°C per qualche min. per la
denaturazione completa del DNA templato genomico. Cicli successivi meno si tiene ad
alta temperatura e meno si compromette l’attivita’ della Taq. Polimerasi 92°- 96°

II Temp. di “annealing” (appaiamento dei primers) Dipende dalla
lunghezza dei primers e dal contenuto in GC/AT (~3 gradi GC/ ~2 gradi AT) dipende
anche dalla concentrazione salina di NaCl e dal pH, ci sono programmi che la calcolano
con un algoritmo. La conc. finale dei primers di solito e’ 15 pmoli. La temperatura si
tiene circa 4-10 gradi sotto la TM (Temp.Melting = 100% di denaturaz.)

III Extension, temperatura ottimale di sintesi della Taq polimerasi 72°C. Si usa ~1
unita’ di enzima per reazione, se il frammento e’ corto se ne puo’ usare 1/2; se il
frammento e’ lungo e il ciclo e’ lungo o ci sono molti cicli, si usano piu’ unita’. Si puo’
spezzare la reazione in due e riaggiungere Taq. Alcune Taq sono più attive vanno
calibrate.Volume aggiunto < 1/10 la soluz. della Taq contiene glicerolo anticongelante

Tempi di ogni passaggio (tipo di termociclatore)
I passaggio: denaturazione iniziale, una sola volta per tutta la reazione da 3’ a
10’ a 94°-95°secondo la lunghezza del frammento.

Ad ogni ciclo: denaturazione a 94°C 15’’- 45’’anche questa a seconda della
lunghezza e dalla % GC/AT

II passaggio: annealing dei primers secondo la TM tenendo la temp. 4°-10°
al di sotto della TM si sceglie la temp. ottimale in modo sperimentale aggiustandola
in modo da evitare amplificazione di frammenti aspecifici.
La durata di questo passaggio puo’ variare da 15’’ad 1 minuto (puo’ dipendere
anche dalla velocita’dello strumento a far variare la temperatura della piastra porta
provette (velocita’ di rampa).

III passaggio: sintesi del DNA a partire dai due primers (extension), la temp. e’
di solito 72°C. La durata puo’ essere di 15’’ fino ad 10 minuti se il frammento
supera le 5 kb fino a 20kb. La temp. puo’ essere piu’ alta (max.75°C) o piu’
bassa. Se non ci sono frammenti aspecifici, si puo’ unificare con la fase di
annealing e il ciclo sara’ di due fasi anche 64°- 68°C.

Conclusioni:
Ogni PCR va aggiustata empiricamente per:
La quantita’ di DNA templato di partenza
La conc. del MgCl standard a 1.5mM(tra 0.5 - 4.5mM)
La conc. dei primers standard 15pmoli
La conc. dei dNTPs da 50mM a 200mM per seq. molto lunghe o molto
DNA da sintetizzare
Il volume di reazione di solito varia tra 15 e 100 µ a seconda della
quantita’ finale di DNA che vogliamo o dello strumento, per PCR
preparative il volume puo’ essere maggiore (però piu’ lento a scaldarsi)
I tempi delle varie fasi (passaggi) dei cicli dipendono anche dal tipo di
macchina* che si usa, dal tipo di provette e dal volume di reaz.
Se e’ moderna* e rapida nel passaggio da una temperatura ad un’altra
delle tre temperature della reazione, si accorciano i tempi del ciclo.

IN LABORATORIO…………
-Cercare le sequenze in banca dati
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
- Per nome del gene, della funzione, di una struttura o di un
elemento o di un dominio funzionale
- Per sequenza con un frammento, con una struttura o un
elemento corrispondente ad una regione con una funzione
specifica,
- per omologia a domini funzionali
-Tramite PCR si ottiene un amplificato corrispondente
all’amplicone compreso tra i due primers prescelti,
selezionati.

Amplificazione del DNA
Blastn con primers noti
sequenze dei DNA
corrispondenti agli ampliconi
A che ci serve amplificare tramite PCR delle sequenze di
DNA note?
- per sequenziarle, se ci si aspettano mutazioni o polimorfismi
- per usarle come sonde (ibridaz. South. North. In-situ)
- per trasformare delle cellule (costrutti con funzioni
specifiche da esprimersi nelle cellule)
- per clonarle
- per mutagenizzarle
- per preparare dei costrutti,
- per fare diagnostica e per n + 1 scopi

Identificare un microrganismo con la
PCR


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